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RaB5 Pulldown Activation Assay Kit

Catalog Number：83701

30 assays

 

產(chǎn)品說(shuō)明

 

   小GTPases是細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)因子的一個(gè)超級(jí)家族。Rab5是Rab5家族的一員GTPases Rab5是早期內(nèi)吞途徑中調(diào)控膜交通動(dòng)力學(xué)的限速元件。目前還沒(méi)有直接測(cè)定Rab5 GTPases激活的方法。

 

 而武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司推出的 Rab5 活性檢測(cè)試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠特異性的識(shí)別特殊構(gòu)象的Rab5-GTP結(jié)合蛋白，而不識(shí)別Rab5-GDP結(jié)合蛋白，進(jìn)而簡(jiǎn)單并且快速的進(jìn)行Rab5的活性檢測(cè)。同時(shí)試劑盒中的Rab5-GTP單克隆抗體也可以進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞和組織中Rab5的活性監(jiān)測(cè)。

 

 檢測(cè)原理

 

   武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的Rab5活性檢測(cè)試劑盒主要是利用識(shí)別蛋白特異構(gòu)象的Rab5-GTP單克隆抗體特異性的去檢測(cè)細(xì)胞提取物或者體外的（樣品需要進(jìn)行GTPγS活化處理）活性Rab5-GTP的水平。簡(jiǎn)言之，特異性識(shí)別Rab5活化構(gòu)象的鼠單克隆抗體可以特異性結(jié)合細(xì)胞裂解液中的Rab5-GTP活性蛋白，然后利用Protein A/G將抗原抗體的結(jié)合物吸附下來(lái)，再利用識(shí)別Rab5蛋白的兔多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡分析進(jìn)行檢測(cè)。

 

試劑盒組份及保存

試劑盒所需自備物品

1. 刺激和未刺激的細(xì)胞裂解物；

2. 蛋白酶抑制劑；

3. 4 °C 搖桿或者搖床；

4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5. 1 M MgCl2；

6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7. 電泳和免疫印跡相關(guān)試劑；

8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；

9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；

10 ECL 檢測(cè)試劑；

 

實(shí)驗(yàn)操作步驟

 

A  試劑制備

1X Assay/Lysis Buffer：實(shí)驗(yàn)前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。 

 

B  樣品處理

  貼壁細(xì)胞

1. 培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)到大約 80%-90%之間（直徑 10 cm 培養(yǎng)皿，~107個(gè)細(xì)胞），并用活性劑或抑制劑進(jìn)行處理。

2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

3. 向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個(gè)直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。

4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。

5. 用細(xì)胞刮棒把細(xì)胞從培養(yǎng)皿下分離下來(lái)。

6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會(huì)變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時(shí)，將細(xì)胞裂解物用 27½的注射器針頭來(lái)回吸取 3-4 次，以破壞基因    組DNA，從而避免上述情況的出現(xiàn)。

8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請(qǐng)將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

懸浮細(xì)胞

1. 培養(yǎng)細(xì)胞并用活化劑或抑制劑進(jìn)行處理。

2. 計(jì)數(shù)細(xì)胞后離心。

3. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

4. 向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個(gè)直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。

5. 反復(fù)吹打細(xì)胞進(jìn)行裂解。

6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會(huì)變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時(shí)，

  將細(xì)胞裂解物用 27½的注射器針頭來(lái)回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。    

8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請(qǐng)將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

 

C.體外用 GTPγS/GDP 處理蛋白以用作陽(yáng)性和陰性的對(duì)照(可選）

注意：在細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有 10% 的 Rab5 被激活，而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的 Rab5 被激活。 

1. 準(zhǔn)備兩個(gè)離心管，每個(gè)管中各加入 0.5 mL 的細(xì)胞提取物（如果是純的 Rab5 蛋白則每個(gè)管中加入的蛋白量為 1ug）。

2. 每個(gè)管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。

3. 一個(gè)管中加入 5ul 的 100X GTPγS（終濃度即為 100 uM）作為陽(yáng)性對(duì)照。另一個(gè)管中加入5ul的 100X GDP（終濃度即為 1 mM）作為陰性對(duì)照。

4. 將離心管置于 30°C 條件下反應(yīng) 30 min 并不斷攪動(dòng)。

5. 終止反應(yīng)：將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。 

 

D. 激活Rab5的親和沉淀

1. 加入 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細(xì)胞裂解物至微量離心管中。

2. 用1XAssay/lysis,把每個(gè)樣品的總體積調(diào)整到1ml

3. 向管中加入 1ul 的活性 Rab5 單克隆抗體。(Cat.# 26911)

4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻，

5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心管中。

6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時(shí)，并輕輕的進(jìn)行搖動(dòng)。

7. 5000g，離心 1 分鐘。

8. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。

9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。

10. 最后一次洗滌后，小心的移去所有的上清。

11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。

12. 樣品煮沸 5min。 

13. 5000g，離心 10s。

 

E. 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 

1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。

2. 按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行 SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說(shuō)明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF 或硝化纖維素膜。 

4. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s，然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意：如果使用的是硝化纖維 素膜，此步省略。 

5. 封閉； 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時(shí)進(jìn)行封閉，并需要恒定振蕩。 

6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 孵育一抗：用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 稀釋Anti-Rab5 PAb(Cat.# 21151),稀釋比例為 1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的 Rab5 蛋 白的量）室溫下孵育 1-2 小時(shí)，或者 4°C 條件下過(guò)夜孵育.

8. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

9. 孵育二抗：（例如羊抗兔 IgG-HRP）用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育 1 小時(shí)并恒定振蕩。

10. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

11. 使用實(shí)驗(yàn)者所選擇的檢測(cè)方法進(jìn)行顯色如 ECL 顯色法。

 

示例結(jié)果

 

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 Rab5 活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考

       

Rab5 活性分析

 純化的Rab5全長(zhǎng)蛋白用GDP處理 (lane 1) 或 GTPγS (lane 2) 用抗活性的Rab5進(jìn)行免疫沉淀(Cat. No. 26911).用 anti Rab5 rabbit polyclonal antibody(Cat. No. 21151). 做免疫印跡分析。

 

 

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Publications:

1.  VASP promotes TGF-β activation of hepatic stellate cells by regulating Rab11 dependent plasma membrane targeting of TGF-β receptors
    Hepatology Volume 61, Issue 1, pages 361–374, January 2015

2.  Rab5 Activity Regulates GLUT4 Sorting into Insulin-Responsive and Non-Insulin-Responsive Endosomal Compartments: A Potential Mechanism for Development of Insulin Resistance
    Endocrinology. 2014 Sep;155(9):3315-28

示例結(jié)果

 

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 Rab5 活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考

       

Rab5 活性分析

 純化的Rab5全長(zhǎng)蛋白用GDP處理 (lane 1) 或 GTPγS (lane 2) 用抗活性的Rab5進(jìn)行免疫沉淀(Cat. No. 26911).用 anti Rab5 rabbit polyclonal antibody(Cat. No. 21151). 做免疫印跡分析。