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G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本原理與研究

                   ——一種高度靈敏的基于特異性單克隆抗體的檢測(cè)方法

來自細(xì)胞外的信號(hào)絕大多數(shù)都是要通過分布于細(xì)胞表面的各種受體傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)部，從而引起細(xì)胞的生理反應(yīng)，發(fā)揮相應(yīng)的功能。

細(xì)胞表面最大的受體家族就是G蛋白偶聯(lián)的受體（G-Protein-Coupled Receptors， GPCRs）。編碼GPCR的基因有1000多個(gè)，占人類基因組總數(shù)超過2%。GPCR是一種7次跨膜蛋白。人類GPCR蛋白至少有數(shù)千種。GPCR被根據(jù)序列同源性被分為3個(gè)大家族：A，B和C。在各個(gè)家族內(nèi)部成員之間在跨膜的核心區(qū)域至少具有25%的序列同源性，并且在一些關(guān)鍵部位的氨基酸是高度保守的。

G蛋白偶聯(lián)受體的信號(hào)需要通過異源三聚體鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白（G-Proteins）傳遞到下游的效應(yīng)蛋白（Effectors）。異源三聚體G蛋白有不同的Ga、Gb和Gg亞基組成。Ga 亞基較大（～35-55 kDa），并具有鳥嘌呤核苷酸結(jié)合和水解能力。在大多數(shù)情況下，當(dāng)Ga 亞基結(jié)合著鳥嘌呤二磷酸核苷酸（GDP）的時(shí)候，能夠結(jié)合一個(gè) Gb 亞基（～35 kDa）和一個(gè) Gg 亞基（～8 kDa）形成異源三聚體復(fù)合物。當(dāng)Ga亞基結(jié)合鳥嘌呤三磷酸核苷酸（GTP）的時(shí)候，Ga 亞基便同Gbg 復(fù)合物分離，形成分別具有獨(dú)立信號(hào)傳導(dǎo)功能的兩個(gè)復(fù)合物。但是Ga亞基具有內(nèi)在的GTP水解活性，能夠催化GTP水解為GDP，從而導(dǎo)致三聚體回到相對(duì)沒有活性的GDP結(jié)合狀態(tài)。多數(shù)情況下結(jié)合著GTP的Ga 亞基是活化的，能夠調(diào)節(jié)下游的效應(yīng)蛋白的活性；而結(jié)合GDP的Ga亞基只有在極少數(shù)情況下可能具有活性。

典型的G蛋白偶聯(lián)受體傳遞信號(hào)的基本原理是：特異性的配體結(jié)合到相應(yīng)的7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）上，引起GPCR構(gòu)象的變化；構(gòu)象變化之后的GPCR能夠結(jié)合相應(yīng)的GDP結(jié)合狀態(tài)的三聚體G蛋白，并誘導(dǎo)三聚體的Ga 亞基構(gòu)象發(fā)生變化，釋放結(jié)合的GDP。處于空置狀態(tài)的Ga 亞基迅速與周圍環(huán)境中的GTP結(jié)合。結(jié)合了GTP的Ga 亞基立即與GPCR和Gbg亞基復(fù)合物分離（如圖）。自由的Ga 亞基和Gbg 亞基分別與下游的效應(yīng)蛋白結(jié)合，通過調(diào)控效應(yīng)蛋白的活性來實(shí)現(xiàn)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。Ga 亞基在同效應(yīng)蛋白結(jié)合的同時(shí)或者之后，水解結(jié)合的GTP成為GDP，于是Ga 亞基在自身的調(diào)節(jié)下關(guān)閉功能，回到非活性的GDP結(jié)合狀態(tài)，并與Gbg 亞基形成三聚體，等待下一次信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。三聚體G蛋白就是通過這樣的循環(huán)來實(shí)現(xiàn)分子信號(hào)的“開”與“關(guān)”，從而使得信號(hào)能夠得到正確有效的傳導(dǎo)。

為了表彰Martin Rodbell和Alfred G. Gillman對(duì)于發(fā)現(xiàn)和揭示三聚體G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的開創(chuàng)性工作，諾貝爾獎(jiǎng)委員會(huì)把1994年的生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予這兩科學(xué)家

。         

GPCR結(jié)合催化三聚體G蛋白交換鳥嘌呤核苷酸示意圖。

GPCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的認(rèn)識(shí)對(duì)于藥物研發(fā)具有非常重要的意義。但是，GPCR的結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)?shù)膹?fù)雜性，以至于盡管GPCR在1870年代就被發(fā)現(xiàn)了，但是對(duì)于其結(jié)構(gòu)和工作原理的了解也只是集中于最近40多年，并且到目前對(duì)于其結(jié)構(gòu)還有很多不清楚的地方。以Brian K. Kobilka和Robert J. Lefkowitz為首的科學(xué)家在GPCR的研究中做出了巨大的貢獻(xiàn)。為了表彰他們研究成果和長期的努力，2012年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)被授予這兩位科學(xué)家。

除了三聚體G蛋白以外，小G蛋白也是一種具有內(nèi)在GTPase活性的鳥苷酸結(jié)合蛋白。他們也能結(jié)合GTP，并將GTP水解成為GDP，實(shí)現(xiàn)類似于三聚體G蛋白的核苷酸循環(huán)，作為分子開關(guān)調(diào)節(jié)信號(hào)通路。與三聚體核鳥苷酸結(jié)合蛋白不同的是，他們是以單體的形式存在，并且分子量較小，大多在20-25kDa之間；他們一般不是像三聚體G蛋白那樣直接與受體結(jié)合介導(dǎo)來自受體的信號(hào)，而是在細(xì)胞內(nèi)間接傳遞來自胞外的信號(hào)。由于最先發(fā)現(xiàn)的小G蛋白是Ras，因此小G蛋白家族也被稱為RAS蛋白超家族。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了154種之多的小G蛋白。這些小G蛋白被分為Ras、Rho、Rab、Arf和Ran等5個(gè)家族。小G蛋白存在于從低等的原核生物到人類之間。小G蛋白有著非常重要的生理功能。有15%的人類腫瘤都與小G蛋白的突變有關(guān)。各個(gè)家族的G蛋白細(xì)胞功能分工有所不同。Ras家族的蛋白調(diào)控基因表達(dá)；Rho家族的蛋白調(diào)控細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)和基因表達(dá)；Rab和Arf家族蛋白調(diào)控細(xì)胞內(nèi)小體的轉(zhuǎn)運(yùn)；Ran家族蛋白調(diào)控細(xì)胞周期中G1、S和G2期的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及M期的微管的形成。

         圍繞GPCR和G蛋白的研究的核心問題之一就是：如何能夠檢測(cè)到GPCR或者說G蛋白是否被激活？這是所有研究G蛋白的科學(xué)家都面臨的一個(gè)非?，F(xiàn)實(shí)的問題。然而，傳統(tǒng)的檢測(cè)手段，例如同位素標(biāo)記的核苷酸，熒光標(biāo)記核苷酸，或者分光光度法，要么操作繁瑣難度大，要么靈敏度不夠，都不盡如人意。最近，NewEast Biosciences的科學(xué)家發(fā)明了一種高度靈敏的基于特異性單克隆抗體的檢測(cè)方法。該方法基于能夠特異性識(shí)別GTP結(jié)合狀態(tài)的三聚體G蛋白或者小G蛋白的單克隆抗體，利用方便快捷的試劑盒，能夠迅速檢測(cè)出G蛋白是否處于激活狀態(tài)。該方法除了具有簡單、易操作、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)以外，還有一個(gè)最為吸引人的優(yōu)勢(shì)：具有捕捉到被固定的細(xì)胞內(nèi)的G蛋白的活化狀態(tài)的可能性。而這正是很多研究G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的科學(xué)家所夢(mèng)寐以求的功能。目前，該類型試劑盒已經(jīng)被100多篇高水平研究論文所引用。隨著這些檢測(cè)方法的普及，G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究進(jìn)展必將進(jìn)一步加快。

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