該免疫熒光實驗方法僅供參考，由于每個實驗使用的試劑不同，并且涉及不同的物種，組織類型及實驗應(yīng)用，實驗人員設(shè)計應(yīng)根據(jù)具體情況設(shè)計實驗步驟和改良。

切片制備

A. 細胞涂片

• 將培養(yǎng)的細胞生長于無菌的蓋玻片或載破片上，37o C過夜孵育。

• 用PBS簡單洗滌。

• 按需固定. 可用的步驟有:

  • 含10% 福爾馬林的PBS 固定10分鐘 (保持濕潤).

  • 冰冷的甲醇固定5分鐘，自然干燥。

  • 冰冷的丙酮固定5分鐘，自然干燥。

• 用PBS沖洗。

B. 冷凍組織切片

• 在液氮或用液氮預(yù)冷的異戊烷中切割冷凍的新鮮組織， 放置于含有OCT凍存液的cryomolds被膜中. 速凍后保存在 – 80 oC。

• 用恒冷箱切片機將組織切成4-8 um 厚的切片，然后固定在急凍切片或明膠包被過的切片。使用前將切片保存于 – 80 oC。

• 染色之前，將切片置于室溫下 30分鐘然后于冰冷的丙酮中固定5分鐘。自然干燥30分鐘。

• 在PBS中漂洗。

C. 石蠟組織切片

• 將切片在二甲苯中去石蠟兩次，每次5min.

• 使用100% 乙醇水化兩次，每次3min.

• 使用95%乙醇水化 1min.

• 蒸餾水漂洗.

• 按需根據(jù)預(yù)制備步驟操作.

組織切片預(yù)制備

*對于非石蠟包埋的冷凍切片和培養(yǎng)細胞，請不要使用該預(yù)制備步驟。

被福爾馬林固定和石蠟包埋封閉的抗原決定簇可以使用抗原修復(fù)劑、酶消化或肥皂精等來使之顯示。

步驟

1. 在PBS-Tween 20 中漂洗切片兩次，每次2分鐘。

2. 血清封閉: 用正常血清封閉孵育切片 – 物種來源應(yīng)與二抗相同, 孵育30分鐘來封閉非特異的免疫球蛋白結(jié)合。 注意：由于該實驗使用的 avidin-biotin 檢測系統(tǒng), 根據(jù)組織類型不同，可能需要avidin/biotin 封閉，avidin/biotin 封閉應(yīng)在正常血清封閉之后。

3. 一抗: 在一抗溶液中孵育切片，室溫下1小時或4 °C過夜。

4. 在PBS-Tween 20中漂洗。

5. 二抗： 在生物素化二抗溶液中孵育切片，室溫下30分鐘。

6. 用PBS-Tween 20 漂洗三次，每次2分鐘。

7. 檢測: 在含F(xiàn)ITC-Avidin D 的PBS溶液中孵育切片，室溫下30分鐘。從該步驟開始要確保切片避光，直到最后將切片用鋁箔紙包裹或放進避光盒子中。

8. 用PBS-Tween 20 漂洗三次，每次2分鐘。

9. 如需要，用PI 或 DAPI 復(fù)染色。

10. 在PBS-Tween 20中漂洗。

11. 用95% 乙醇脫水 2 分鐘, 100% 乙醇脫水兩次，每次3分鐘。

12. 用抗褪色固定介質(zhì)覆蓋切片。