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一、目的要求

1、掌握多克隆抗體的制備原理；

2、熟悉多克隆抗體的制備過程

3、了解多克隆抗體效價(jià)的鑒定與判斷方法

二、原理

抗原分子通常具有多個(gè)抗原表位，用抗原免疫動(dòng)物后，可激發(fā)多種具有相應(yīng)抗原受體的B細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答。由活化的B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞分泌抗體進(jìn)入血液，從血清中分離出多種針對(duì)不同抗原表位抗體的混合物即為多克隆抗體(polyclonal antibody,pAb),也稱免疫血清或抗血清。

   高效價(jià)抗血清的獲取，主要取決于抗原的純度、免疫原性及免疫程序（如免疫途徑、抗原劑量、注射次數(shù)與周期等）。為提高抗原的免疫原性，可在免疫動(dòng)物時(shí)加用佐劑。常用的是弗氏佐劑包括弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑兩種。

三、材料

1、純化的人免疫球蛋白IgG。

2、生理鹽水或PBS。

3、弗氏完全及不完全佐劑（可自行制作或購(gòu)買成品）。

4、健康成年兔，雄雌不限，體重1.5～2.5kg。

5、Eppendorf、金屬鑷子、無菌注射器及6號(hào)與9號(hào)注射針頭。

6、動(dòng)物固定架，手術(shù)器械。

7、酒精棉球及碘氟等。

四、方法

1、按150～200微克/公斤體重稱取人免疫球蛋白Ig溶于0.5ml生理鹽水進(jìn)行計(jì)算。置于適當(dāng)容器中進(jìn)行溶解。

2、逐滴加入等體積的弗氏完全佐劑，用裝有9號(hào)注射針頭的注射器反復(fù)抽吸進(jìn)行乳化，直至取1滴放在冰水面上，不散開即為形成了乳化劑。

3、將體重適宜的健康家兔，用剪刀剪去頸背部及后腳掌的毛發(fā)，固定好。用碘

氟、酒精消毒皮膚。

4、用2ml的注射器吸取抗原溶液1ml,于兔頸背部及后腳掌皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.1～0.2ml。

5、間隔2周重復(fù)免疫，抗原的劑量及注射部位同上，應(yīng)用弗氏不完全佐劑進(jìn)行

乳化。免疫3～4次。

6、末次免疫，可經(jīng)靜脈注射不加佐劑的抗原溶液，劑量為首次免疫的50～60%。

7、免疫血清的效價(jià)測(cè)定：末次免疫后10天左右，從耳緣靜脈取血少許，4℃放置4小時(shí)以上，以2000r/min離心10分鐘，收獲血清。采用免疫雙擴(kuò)散方法測(cè)定抗體的效價(jià)。

8、經(jīng)測(cè)定，如抗體效價(jià)達(dá)到要求（一般為1:16以上），采用頸動(dòng)脈放血法收集血液（應(yīng)無菌操作），待其凝固后離心收獲血清。

五、注意事項(xiàng)

1、抗原乳化劑的制備、動(dòng)物免疫及收獲血清等實(shí)驗(yàn)過程中均應(yīng)注意無菌操作。

2、動(dòng)物免疫的抗原用量及免疫次數(shù)因抗原的性質(zhì)及不同的動(dòng)物種類而異。一般免疫3～4次。

3、如經(jīng)鑒定，抗體效價(jià)較低，可再免疫1～2次后收獲免疫血清。

六、思考題

1、免疫動(dòng)物的途徑大多采用皮下注射，為什么？

2、制備可溶性抗原的溶液時(shí)，加用免疫佐劑的目的是什么？

附：免疫血清的保存方法

    為了減慢抗體效價(jià)降低的速度，免疫血清一般采取無菌、低溫、高濃度及加防腐劑的方法保存。收獲的免疫血清應(yīng)立即進(jìn)行分裝后-80℃冷凍保存。視具體情況（如免疫血清僅用于體外的實(shí)驗(yàn)研究），可加入0.01～0.02%的疊氮鈉（NaN₃）作為防腐劑。保存過程中盡可能減少凍溶的次數(shù)，以免抗體變性，效價(jià)降低。