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| 027-87561033
PRODUCT CENTER
| 價(jià)格 | ￥6800.00 |
| 品牌 | NewEast Biosciences  |
| 產(chǎn)地 | 中國 武漢 |
| 貨號 | 81501 |
| 規(guī)格 | 30 Assays |
| 說明書 | 說明書下載 |
Configuration-specific Monoclonal Antibody Based
RalB Activation Assay Kit
Catalog Number：81501
30 assays
產(chǎn)品說明
小GTPases是細(xì)胞信號調(diào)節(jié)因子的一個超級家族。Ras樣小G蛋白RalA/B是Ras信號通路的重要組成部分，參與了致瘤轉(zhuǎn)化的起始和維持，以及囊泡運(yùn)輸、凋亡、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞遷移和細(xì)胞增殖。目前還沒有直接測定Ral GTPases活性的方法。
武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司推出的Ral活性檢測試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠特異性的識別特殊構(gòu)象的Ral結(jié)合蛋白，而不識別RalA結(jié)合蛋白，進(jìn)而簡單并且快速的進(jìn)行Ral的活性檢測。同時(shí)試劑盒中的Ral-GTP單克隆抗體也可以進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞和組織中Ral的活性監(jiān)測。
檢測原理
武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 RalB 活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異構(gòu)象的RalB- GTP 單克隆抗體特異性的去檢測細(xì)胞提取物或者體外的（樣品需要進(jìn)行 GTPγS 活化處理）活性 RalB GTP 的水平。簡言之，特異性識別 RalB 活化構(gòu)象的鼠單克隆抗體可以特異性結(jié)合細(xì)胞裂解液中的 RalB GTP 活性蛋白，然后利用 Protein A/G 將抗原抗體的結(jié)合物吸附下來，再利用識別 RalB的兔多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡分析進(jìn)行檢測
試劑盒組份及保存
試劑盒所需自備物品
1. 刺激和未刺激的細(xì)胞裂解物；
2. 蛋白酶抑制劑；
3. 4 °C 搖桿或者搖床；
4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；
5. 1 M MgCl2；
6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；
7. 電泳和免疫印跡相關(guān)試劑；
8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；
9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；
10 ECL 檢測試劑；
實(shí)驗(yàn)操作步驟
A 試劑制備
1X Assay/Lysis Buffer：實(shí)驗(yàn)前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。
B 樣品處理
貼壁細(xì)胞
1. 培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)到大約 80%-90%之間（直徑 10 cm 培養(yǎng)皿，~107個細(xì)胞），并用活性劑或抑制劑進(jìn)行處理。
2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。
3. 向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。
4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。
5. 用細(xì)胞刮棒把細(xì)胞從培養(yǎng)皿下分離下來。
6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。
7. 如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時(shí)，將細(xì)胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因 組DNA，從而避免上述情況的出現(xiàn)。
8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。
9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。
懸浮細(xì)胞
1. 培養(yǎng)細(xì)胞并用活化劑或抑制劑進(jìn)行處理。
2. 計(jì)數(shù)細(xì)胞后離心。
3. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。
4. 向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。
5. 反復(fù)吹打細(xì)胞進(jìn)行裂解。
6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。
7. 如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時(shí)，
將細(xì)胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。
8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。
9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。
C.體外用 GTPγS/GDP 處理蛋白以用作陽性和陰性的對照(可選）
注意：在細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有 10% 的 RalB 被激活，而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的 RalB 被激活。
1. 準(zhǔn)備兩個離心管，每個管中各加入 0.5 mL 的細(xì)胞提取物（如果是純的RalB 蛋白則每個管中加入的蛋白量為 1ug）。
2. 每個管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。
3. 一個管中加入 5ul 的 100X GTPγS（終濃度即為 100 uM）作為陽性對照。另一個管中加入 5ul 的 100X GDP（終濃度即為 1 mM）作為陰性對照。
4. 將離心管置于 30°C 條件下反應(yīng) 30 min 并不斷攪動。
5. 終止反應(yīng)：將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。
D. 激活Ral的親和沉淀
1. 加入 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細(xì)胞裂解物至微量離心管中。
2. 用1X Assay/Lysis 緩沖液。把每個樣品的體積調(diào)整到1ml
3. 向管中加入 1ul 的活性 Ral 單克隆抗體。(Cat.# 26913)
4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻，
5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心管中。
6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時(shí)，并輕輕的進(jìn)行搖動。
7. 5000g，離心 1 分鐘。
8. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。
9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。
10. 最后一次洗滌后，小心的移去所有的上清。
11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。
12. 樣品煮沸 5min。
13. 5000g，離心 10s。
E. 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)
1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。
2. 按照制造商的說明進(jìn)行 SDS-PAGE。
3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF 或硝化纖維素膜。
4. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s，然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意：如果使用的是硝化纖維 素膜，此步省略。
5. 封閉； 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時(shí)進(jìn)行封閉，并需要恒定振蕩。
6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。
7. 孵育一抗：用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 稀釋Anti-RalB PAb(Cat.# 21033),稀釋比例為 1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的 RalB 蛋 白的量）室溫下孵育 1-2 小時(shí)，或者 4°C 條件下過夜孵育.
8. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。
9. 孵育二抗：（例如羊抗兔 IgG-HRP）用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育 1 小時(shí)并恒定振蕩。
10. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。
11. 使用實(shí)驗(yàn)者所選擇的檢測方法進(jìn)行顯色如 ECL 顯色法。
示例結(jié)果
下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 RalB 活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。
RalB 活性分析
純化的RalA蛋白 用GDP處理 (lane 1) 或 GTPγS (lane 2).用抗活性的 Ral 進(jìn)行免疫沉淀(Cat. No. 26913).用 anti RalB rabbit polyclonal antibody(Cat. No. 21033). 做免疫印跡分析。
| Related Products | |||
| Catalog# | Name | Size | Price |
| 83601 | RalA Activation Assay Kit | 20 assays | ￥6800 |
| 81501 | RalB Activation Assay Kit | 20 assays | ￥6800 |
| 26913 | Active Ral-GTP Monoclonal Antibody | 30 μL | ￥4800 |
| 26018 | Anti-RalB Mouse Monoclonal Antibody | 100 μL | ￥2800 |
| 21034 | Anti-RalA Rabbit Polyclonal Antibody | 100 μL | ￥2600 |
| 21033 | Anti-RalB Rabbit Polyclonal Antibody | 100 μL | ￥2600 |
示例結(jié)果
下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 RalB 活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。
RalB 活性分析
純化的RalA蛋白 用GDP處理 (lane 1) 或 GTPγS (lane 2).用抗活性的 Ral 進(jìn)行免疫沉淀(Cat. No. 26913).用 anti RalB rabbit polyclonal antibody(Cat. No. 21033). 做免疫印跡分析。
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