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英文名稱 ：cAMP(Cyclic adenosine monophosphate) ELISA KIT

規(guī)   格：96T

貨   號(hào)：80203

 

靈敏度：22.9fmol/ml   檢測(cè)范圍：0.08pmol/ml-250pmol/ml

 

產(chǎn)品說(shuō)明

環(huán)磷腺苷酸(cAMP)和環(huán)磷鳥(niǎo)苷酸(cGMP)是在通過(guò)對(duì)特定蛋白激酶作用來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)能量代謝的過(guò)程中非常重要的第二信使分子。兩者都富含于中樞神經(jīng)系統(tǒng)當(dāng)中,AMP參與較高的皮質(zhì)功能,而cGMP參與光轉(zhuǎn)導(dǎo)。cAMP是三磷酸腺苷(ATP)的衍生物 ，在多種不同生物體的細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)cAMP依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。cAMP參與細(xì)胞代謝、分化、增殖的跨 膜調(diào)控機(jī)制在惡性生長(zhǎng)中具有良好的 細(xì)胞抑制和調(diào)節(jié)體內(nèi)平衡的作用。

目前商業(yè)化提供的一些cAMP檢測(cè)試劑盒主要應(yīng)用ELISA的方案 ，使用的是非親和純化的cAMP多克隆抗體.盡管具有靈敏性,這些多克隆抗體與ATP存在一定程度的交叉反應(yīng)?；?/span>ATP是cAMP生產(chǎn)的底物 很有必要找到一種能高特異性識(shí)別cAMP的抗體。

紐斯特生物開(kāi)發(fā)出了唯一的鼠單克隆抗體的cAMP ELISA 檢測(cè)試劑盒。該單克隆抗體對(duì)cAMP的特異性比cAMP、ATP等類似的小分子高出108 倍以上。相較于其他的多克隆抗體cAMP試劑盒,紐斯特生物cAMP ELISA試劑盒能顯著的提高其靈敏性和特異性 ，且能有效避免來(lái)自動(dòng)物多克隆抗體的批次間差異 ，因此可以提供長(zhǎng)久有效地可重復(fù)性定量檢測(cè)。

紐斯特生物cAMP ELISA試劑盒能顯著的提高其靈敏性和特異性,且能有效避免來(lái)自動(dòng)物多克隆抗體的批次間差異 ，因此可以提供長(zhǎng)久有效地可重復(fù)性定量檢測(cè)。此外 ，其他ELISA試劑盒的多克 隆抗cAMP抗體與乙?；?/span>cAMP的親和力明顯高于非乙酰化cAMP.本試劑盒的單克隆cAMP抗體與乙?；蚍且阴；?/span>cAMP具有同樣的親和力。因此.紐斯特生物cAMP ELISA試劑盒中的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品不需要乙?；幚?，從而明顯縮短了分析時(shí)間 ，有效避免了乙酰化過(guò)程中的有機(jī)試劑的使用 ，為大家提供了一個(gè)更安全.更健康的工作環(huán)境。

 

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒利用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法來(lái)測(cè)定細(xì)胞提取物或體外腺苷酸環(huán)化酶實(shí)驗(yàn)中的cAMP的水平。簡(jiǎn)而言之，將羊抗鼠多克隆抗體包被在酶標(biāo)板上,細(xì)胞提取物或體外腺苷酸環(huán)化酶實(shí)驗(yàn)中的cAMP與固定數(shù)量的偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的cAMP或堿性磷酸酶競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合抗cAMP單克隆抗體,已知的cAMP作為標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間孵育 ，洗掉所有試劑 ，加入底物進(jìn)行顯色。將 多孔板置于酶標(biāo)儀上 于450nm或405nm波長(zhǎng)下 ，進(jìn)行讀數(shù)。黃色的光強(qiáng)度與樣品中cAMP的濃度 呈反比關(guān)系?；?/span>cAMP標(biāo)準(zhǔn)品所得曲線 ，通過(guò)測(cè)得的光密度可以計(jì)算出樣品中cAMP的濃度。

研究背景:cAMP作為獨(dú)特的第二信使 ，可調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)各種外源和內(nèi)源信號(hào)分子的反應(yīng)。它主要通過(guò)激活蛋 白激酶、控制特定的離子通道、磷酸二酯酶調(diào)節(jié)細(xì)胞環(huán)核苷酸濃度以及激Epac(通過(guò)cAMP直接激活蛋白交換)(3-6)來(lái)調(diào)節(jié)生理過(guò)程。通過(guò)腺苷酸環(huán)化酶可以實(shí)現(xiàn)ATP轉(zhuǎn)化為cAMP。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的主 要腺苷酸環(huán)化酶家族均是橫跨膜的 ，具有9個(gè)亞型 ，且可通過(guò)G蛋白Gs或鈣離子/鈣調(diào)素(1)激活。另外,還有一種可溶性的腺苷酸環(huán)化酶.可以通過(guò)碳酸鹽或Ca2 +調(diào)節(jié)(7)。

 

試劑盒組分及保存

  

組份	貨號(hào)	儲(chǔ)存溫度
1.Goat anti-Mouse IgG Coated plate of 96 wells 12x8 well strips in a bag with desiccant	30101	2-8℃
2. cAMP-HRP 1000x stock of HRP conjugated with cAMP, 1x6ul	30202	-80°C
3. cAMP Antibody Anti-cAMP monoclonal antibody (1000X stock), 1x6ul	26002-2	-80°C
4. Neutralizing Reagent tris buffered saline with preservative, 1x6mL	30103	2-8℃
5.10x Assay Buffer phosphate buffer with preservative, 1x15mL	30106	2-8℃
6. cAMP Standard 5000 pmol/mL cAMP, 1x0.1mL	30203	-80°C
7.Substrate A 12ml	30107	2-8℃
8.Substrate B 12ml	30108	2-8℃
9.Sample Diluent                                                                   0.1M HCl, only required for extraction of samples and diluting standard, 1x15mL	30109	2-8℃
10. Stop Solution 2M sulphuric acid, 1x6mL	30110	2-8℃

注：收到試劑盒后 ，若不立即使用 ，請(qǐng)按照標(biāo)簽說(shuō)明存儲(chǔ)在相應(yīng)的溫度。

 

試劑盒所需自備物品

1.去離子水或蒸餾水。

2.濃鹽酸。

3.量程在5μ L至1000μ L之間的精密移液管。

4.量程為50μ L和200μ L的中繼移液器。

5.用于稀釋儲(chǔ)液的一次性燒杯。

6.刻度量筒。

7.微孔板振蕩器。

8.吸水紙。

9.酶標(biāo)儀 ，可讀波長(zhǎng)450nm ，在570nm至590nm之間應(yīng)有修正。

 

樣品處理：

 

紐斯特生物的ELISA試劑盒適用于檢測(cè)經(jīng)過(guò)鹽酸處理而終止內(nèi)源性磷酸二酯酶活性的cAMP樣品。這種樣品可直接應(yīng)用于檢測(cè),而不需要蒸發(fā) 和進(jìn)一步的處理。

組織樣本：需預(yù)先冰凍于液氮中。在不銹鋼研缽中用液氮將組子樣本研磨成精細(xì)粉末。待液氮揮 發(fā)完后 ，稱量冰凍組織樣本并加入10倍體積的0.1M HCl混勻。室溫以大于600g離心力離心 ，取上層清夜用0.1M HCl稀釋至適當(dāng)濃度。

細(xì)胞樣本：首先移除培養(yǎng)基,然后加入0.1MHCl處理細(xì)胞。孵育10分鐘,并觀察細(xì)胞是否被裂解；如果裂解充分,接著孵育10分鐘并觀察。  以大于600g離心力于室溫離心,收集上清直接用于實(shí)驗(yàn)。臨用前在0.1M HCl中加入0.1%至1%濃度的Triton-x 100可增強(qiáng)細(xì)胞和組織裂解。

尿液，血漿和培養(yǎng)液：每ml樣品中加入10µL濃鹽酸（12M）混勻后，室溫離心5min（600 g）留上清，用于本試劑盒檢測(cè)。血漿、血清、全血和組織勻漿通常含有磷酸二酯酶（phosphodiesterases）和大量免疫球蛋白（Ig），它們會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)。用0.1 M HCl處理樣品，可以滅活磷酸二酯酶和降低免疫球蛋白的濃度，使之可以用于本試劑盒。

 

試劑盒注意事項(xiàng):

 

 1.收到試劑盒后若不立即使用,請(qǐng)將試劑按照標(biāo)簽說(shuō)明存儲(chǔ)在相應(yīng)的溫度,-80℃低溫保存的抗體和酶儲(chǔ)液為避免反復(fù)凍融請(qǐng)按每次需要量進(jìn)行分裝凍 存,若立即使用，請(qǐng)將整個(gè)試劑盒置于4℃保存。

2.使用前請(qǐng)將試劑盒各個(gè)試劑平衡到室溫(至少30min)  。

3.用試劑預(yù)先潤(rùn)洗槍頭在使用；取各種樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和試劑必需更換槍頭。

4.移取標(biāo)準(zhǔn)品和樣品到微孔底部。

5.從微孔的邊緣加入試劑,以避免污染。

6.本試劑盒使用可拆分的微孔酶標(biāo)條,使用者可根據(jù)樣品量多少進(jìn)行拆分。未使用的酶標(biāo)條保持干燥,密封于試劑盒提供的鋁封袋中,于4℃保存。微孔酶標(biāo)條需安裝在相應(yīng)的框架上使用。

7.在加入顯色底物前 ，確保微孔內(nèi)沒(méi)有殘留的洗滌液。微量殘留的洗滌液可能導(dǎo)致分析結(jié)果的變化。

 

試劑制備

 

1.非乙酰化cAMP標(biāo)準(zhǔn)品溶液

 

  將5000 pmol/mL cAMP標(biāo)準(zhǔn)品溶液平衡至室溫。從#1至#6標(biāo)記六只潔凈試管。移取475μL 0.1M HCl到#1號(hào)試管,400μL到#2至#6號(hào)試管。加入25μL 5000 pmol/mL cAMP標(biāo)準(zhǔn)品到#1管中,劇烈渦旋震蕩。從#1管中取出100μL溶液至#2管中,渦旋震蕩。以此類推，重復(fù)上步操作.梯度稀釋至#6管。經(jīng)以上操作，#1至#6管中cAMP標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為250, 50，10, 2, 0.4 和0.08 pmol/mL (詳見(jiàn)cAMP實(shí)驗(yàn)稀釋操作流程圖).稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品需在30分鐘內(nèi)使用。標(biāo)記一只試管作為無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品空白對(duì)照(NSB)。移取600μL 0.1M HCl到NSB管中。

 

 2.洗滌液

 

  將15mL 10×洗滌液儲(chǔ)液加到135 mL去離子水中，稀釋成工作液。稀釋液可在室溫保存至試劑盒有效期限,或者3個(gè)月。

 

3. cAMP-HRP Conjugate工作液

 

  實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量(以50ul/孔計(jì)算)，實(shí)際配置時(shí)應(yīng)多配置100-200ul.使用前15分鐘，用配好的1xAssay Buffer,將cAMP-HRP Conjugate (1000X),稀釋成1x工作濃度。當(dāng)日使用。

 

4.Anti-cAMP McAb工作液

 

 實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量(以50ul/孔計(jì)算)，實(shí)際配置時(shí)應(yīng)多配置100-200ul.使用前15分鐘 ，用配好的1xAssay Buffer,將cAMP-HRP Conjugate (1000×) 稀釋成1x工作濃度。當(dāng)日使用。

 

5.操作步驟

使用前將各種試劑取出放置30分鐘,平衡至室溫。所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必需設(shè)置平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。快速加入試劑至樣品中,立即漩渦震蕩2秒混勻。

1.依據(jù)實(shí)驗(yàn)鍵盤紙決定酶標(biāo)條的使用量,將剩余的酶標(biāo)條連同干燥劑一起放回密封塑料袋，密封，4℃保存。

2.移取50μL中和液至各個(gè)微孔中 除了TA(Total Activity)孔和Blank(空白)孔。

3.移取100μL 0.1M HCl至NSB (Non-Specific Binding)孔和B0孔(0pmol/mL cAMP標(biāo)準(zhǔn)品)。

4. 移取100μL cAMP標(biāo)準(zhǔn)品至相應(yīng)的孔。

5. 移取100μL樣品至相應(yīng)的孔。

6. 移取50μ L 0.1M HCl至NSB  ( Non-Specific Binding)  孔。

7.移取50μ L 偶聯(lián)酶至各孔中 ，除了TA  (Total Activity)  孔和Blank(空白)孔。

8. 移取50μ L 抗體工作液至各孔中 ，除了TA  (Total Activity)  孔Blank(空白)孔和NSB  ( Non-Spe cific Binding)  孔。

9. 將酶標(biāo)孔置于孔板振動(dòng)器上 ，250~500rpm ，室溫孵育2時(shí)。           

10. 在吸水紙上拍干微孔內(nèi)溶液 ，加洗滌液300μ L每孔洗三次 ，每次需拍干。

11. 最后一次洗滌 ，清空各微孔 ，在干凈的無(wú)塵吸水紙上輕巧酶標(biāo)板數(shù)次 ，以確保沒(méi)有洗滌液殘留。

12. 加5μ L 偶聯(lián)酶至TA  (Total Activity)  孔。

13.每孔200μ L顯色底物溶液 ，于室溫靜置5~30分鐘。    (顯色底物A和B需在臨用前15分鐘內(nèi)等體積 混合 ，并避光放置。  )

14. 每孔加入50μ L終止液。終止后立即讀數(shù)。

15.清除酶標(biāo)儀Blank(空白)孔值 ，讀取450nm處的光密度值 ，在570nm至590nm之間最好有修正。 如果酶標(biāo)儀不能自動(dòng)清除Blank(空白)孔值 ，那么手動(dòng)扣除每個(gè)讀數(shù)的Blank(空白)孔光密度值。

 

結(jié)果判斷

1 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的凈光密度(OD)平均值的計(jì)算：凈OD平均值 = OD平均值－NSB孔OD平均值
2 計(jì)算不同梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)合率占最大結(jié)合率(B0孔)的百分比 ，計(jì)算公式 如下： 百分比值 = (凈OD平均值/ B0孔OD平均值)×100
3 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，凈OD值為縱坐標(biāo)，通過(guò)四參數(shù) Logistic 曲線擬合繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)樣品中的插值，即可得到樣品中cAMP的濃度

 

標(biāo)準(zhǔn)曲線

下面的曲線不能用于計(jì)算cAMP濃度。每次實(shí)驗(yàn)需新做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 

   

 

靈敏度

通過(guò)比較10個(gè)B0孔平均光密度值(OD)和10個(gè)5號(hào)管標(biāo)準(zhǔn)品的平均光密度值 ，計(jì)算出靈敏度。cAMP 濃度的檢測(cè)極限通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線上0位置的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)測(cè)定。

OD(B0平均數(shù)) =0.685± 0.003

OD  ( 5號(hào) 標(biāo)準(zhǔn)品平均數(shù))  =0.604± 0.010

光密度偏差(0-0.4 pmol/mL) =0.081

2 SD's of the Zero Standard =0.006

靈敏度 =081.0006.0/0.8 ×0.4 pmol/mL =29.6 fmol/mL

 

 

線性關(guān)系

 

cAMP濃度為16.0pmol/mL的樣品，用0.1M HCl進(jìn)行連續(xù)七次1:2梯度稀釋。將實(shí)際的cAMP濃度和測(cè)定的cAMP濃度繪制圖表。該直線的斜率為1.000 ，相關(guān)系數(shù)為0.999。

  交叉反應(yīng)部分相關(guān)化合物的交叉反應(yīng)由競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定。將可能的交叉反應(yīng)物溶解到試劑盒分析緩沖液中 ，濃度從500pmol/mL- 500,000pmol/mL。這些樣品通過(guò)乙酰化在cAMP競(jìng)爭(zhēng)分析中被測(cè)定 ，通過(guò)比  較樣品中交叉試劑的實(shí)際濃度 ，可以計(jì)算出交叉反應(yīng) ，并用百分比(%)表示。