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Direct cGMP ELISA Kit
(New Non-acetylated Version)
Catalog No.80103
96 Well Kit

靈敏度：14fmol/ml    檢測范圍：0.016pmol/ml-250pmol/ml

產(chǎn)品描述

工作原理

研究背景

試劑盒組份及保存

      注： 收到試劑盒后 ，若不立即使用 ，請按照標簽說明存儲在相應(yīng)的溫度。 

試劑盒所需自備物品

樣品處理

     紐斯特生物的ELISA試劑盒適用于檢測經(jīng)過鹽酸處理而終止內(nèi)源性磷酸二酯酶活性的cAMP樣品。 這種樣品可直接應(yīng)用于檢測，而不需要蒸發(fā)和進一步的處理。

 試劑盒注意事項

1. 收到試劑盒后若不立即使用 ，請將試劑按照標簽說明存儲在相應(yīng)的溫度 ， -80℃低溫保存的抗體和 酶
儲液為避免反復凍融請按每次需要量進行分裝凍存；若立即使用，請將整個試劑盒置于4℃保存。
2. 使用前請將試劑盒各個試劑平衡到室溫 (至少30min) 。
3. 用試劑預先潤洗槍頭在使用；取各種樣品、標準品和試劑必需更換槍頭。
4. 移取標準品和樣品到微孔底部。
5. 從微孔的邊緣加入試劑 ，以避免污染。
6. 本試劑盒使用可拆分的微孔酶標條 ，使用者可根據(jù)樣品量多少進行拆分。未使用的酶標條保持干 燥
，密封于試劑盒提供的鋁封袋中 ，于4℃保存。微孔酶標條需安裝在相應(yīng)的框架上使用。
7. 在加入顯色底物前 ，確保微孔內(nèi)沒有殘留的洗滌液。微量殘留的洗滌液可能導致分析結(jié)果的變化。

 試劑準備

 1. 非乙酰化cGMP標準品

將5000 pmol/mL cGMP標準品溶液平衡至室溫。從#2至#7標記七只潔凈管。移取475μ L 0.1MHCl 到 #1號試管 ，400μl 到 #2至 #7號試管。加入25μl 5000 pmol/mL cGMP標準品到 #1管中,劇烈渦旋震蕩。從 #1管中取出100 μl溶液至 #2 管中 ，渦旋震蕩，以此類推, 重復上步操作 ，梯度稀釋至#7管。經(jīng)以上操作 ，#1至 #7 管中cGMP標準品濃度分別為 250, 50 ，10, 2 , 0.4, 0.08 和 0.016pmol/mL (詳見cGMP實驗稀釋操作流程圖) 。稀釋過的標準品需在30分鐘內(nèi)使用。標記 一只試管作為無標準品空白對照 ( BO) .移 600μl 0.1M HCl 到 B0 管中。

  2.1xAssay Buffer

將15 mL 10×Assay Buffer 加到135 mL去離子水中 ，稀釋成工作液。稀釋液可在室溫保存至試劑盒有效期限 ，或者3個月

3.cGMP-HRP 工作液

實驗前計算當次實驗所需用量 (以50ul/孔計算) ，實際配置時應(yīng)多配置100-200ul.使用前15分鐘 ，用配好的1x Assay Buffer,將cGMP-HRP Conjugate ( 1000×) 稀釋成1x工作濃度。 當日使用。

4.Anti-cGMP McAb 工作液

實驗前計算當次實驗所需用量 (以50ul/孔計算) ，實際配置時應(yīng)多配置100-200ul.使用前15分鐘 ，用配好的1x Assay Buffer,將Anti-cGMP Antibody ( 1000×) 稀釋成1x工作濃度。 當日使用。

 實驗步驟

  使用前將各種試劑取出放置30分鐘 ，平衡至室溫。所有標準品和樣品必需設(shè)置平行對照實驗?？焖偌尤朐噭┲翗悠分?,立即漩渦震蕩2秒混勻。
1. 依據(jù)實驗鍵盤紙決定酶標條的使用量 將剩余的酶標條連同干燥劑一起放回密封塑料袋，密封，4℃保存
2. 移取50μ L中和液至各個微孔中，除了 TA ( TotalActivity) 孔 和 Blank (空白)孔。
3. 移取100μ L 0.1M HCl 至NSB ( Non-Specific Binding) 孔 和 B0孔 (0pmol/mL cGMP標準品)。
4. 移取100μ L cGMP標準品至相應(yīng)的孔。
5. 移取100μ L樣品至相應(yīng)的孔。
6. 移取50μ L 1x Assay Buffer 至NSB ( Non-Specific Binding) 孔。
7. 移取50μ L偶聯(lián)酶至各孔中 ，除了TA (TotalActivity) 孔和 Blank (空白) 孔。
8. 移取50μ L 抗體工作液至各孔中，除了TA (TotalActivity) 孔，Blank(空白)孔。
9. 將酶標孔置于孔板振動器上 ，250~500rpm ，室溫孵育2小時。
10. 在吸水紙上拍干微孔內(nèi)溶液 ，加洗滌液 250 μ L每孔洗3次，每次需拍干。
11. 最后一次洗滌 ，清空各微孔 ，在干凈的無塵吸水紙上輕巧酶標板數(shù)次 ，以確保沒有洗滌液殘留。
12. 加5μ L 偶聯(lián)酶至TA (Total Activity) 孔。
13. 每孔 200μ L顯色底物溶液 ，于室溫靜置5~30分鐘。(顯色底物A和B需在臨用前15分鐘內(nèi)等體積混合 ，并避光放置)
14. 每孔加入50μ L終止液。終止后立即讀數(shù)。
15. 清除酶標儀Blank(空白)孔值 ，讀取450nm處的光密度值 ，在570nm至590nm之間最好有修正。如果酶標儀不能自動清除Blank(空白)孔值 ，那么手動扣除每個讀數(shù)的Blank(空白)孔光密度值。

下面的曲線不能用于計算cGMP濃度。每次實驗需新做一條標準曲線。

靈敏度

通過比較10個B0孔平均光密度值(OD)和10個#6管標準品的平均光密度值，計算出靈敏度。cGMP濃度的檢測極限通過標準曲線上0位置的兩個標準偏差來測定。

線性關(guān)系

cGMP濃度為16.0pmol/mL的樣品，用0.1M HCl進行連續(xù)七次1:2梯度稀釋。將實際的cGMP濃度和測定的cGMP濃度繪制圖表。該直線的斜率為1.000，相關(guān)系數(shù)為0.999。

交叉反應(yīng)

部分相關(guān)化合物的交叉反應(yīng)由競爭ELISA測定。將可能的交叉反應(yīng)物溶解到試劑盒分析緩沖液中，濃度從500 pmol/mL至500,000 pmol/mL。將這些樣品用該試劑盒測定，實測cGMP濃度以50%B/Bo進行計算。交叉反應(yīng)的%通過比較檢測到的交叉反應(yīng)物濃度和實際的反應(yīng)物濃度得到，并以百分比的形式表示。