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Sar1A Pulldown Activation Assay Kit

Catalog Number：81801

30 assays

 

  產(chǎn)品說(shuō)明

 

小GTPases是細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)因子的一個(gè)超級(jí)家族。Sar1就是其中的一員GTP ase。Sar1作為一個(gè)分子開(kāi)關(guān)控制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-脂質(zhì)直接從ER中出芽的囊泡的相互作用。Sar1參與膜運(yùn)輸，并且規(guī)定了COPII涂層的裝配和拆卸。目前還沒(méi)有直接測(cè)定Sar1 GTPases激活的方法.

 

 

而武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司推出的 Sar1 活性檢測(cè)試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠特異性的識(shí)別特殊構(gòu)象的 Sar1 GTP 結(jié)合蛋白，而不識(shí)別 Sar1 GDP 結(jié)合蛋白，進(jìn)而簡(jiǎn)單并且快速的進(jìn)行 Sar1 的活性檢測(cè)。同時(shí)試劑盒中的 Sar1 GTP 單克隆抗體也可以進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞和組織中 Sar1 的活性監(jiān)測(cè)。每套試劑盒可以進(jìn)行 30 次檢測(cè)。

 

 

檢測(cè)原理

 

 武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 Sar1  活性檢測(cè)試劑盒主要是利用識(shí)別蛋白特異構(gòu)象的Sar1 GTP 單克隆抗體特異性的去檢測(cè)細(xì)胞提取物或者體外的（樣品需要進(jìn)行 GTPγS 活化處理）活性 Sar1  GTP 的水平。簡(jiǎn)言之，特異性識(shí)別 Sar1 活化構(gòu)象的鼠單克隆抗體可以特異性結(jié)合細(xì)胞裂解液中的 Sar1  GTP 活性蛋白，然后利用 Protein A/G 將抗原抗體的結(jié)合物吸附下來(lái)，再利用識(shí)別 Sar1 的兔多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡分析進(jìn)行檢測(cè)

 

 試劑盒組份及保存

 

   

 

  

   試劑盒所需自備物品

 

1. 刺激和未刺激的細(xì)胞裂解物；

2. 蛋白酶抑制劑；

3. 4 °C 搖桿或者搖床；

4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5. 1 M MgCl2；

6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7. 電泳和免疫印跡相關(guān)試劑；

8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；

9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；

10 ECL 檢測(cè)試劑；

 

 實(shí)驗(yàn)操作步驟

 

A  試劑制備

1X Assay/Lysis Buffer：實(shí)驗(yàn)前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。 

 

B  樣品處理

  貼壁細(xì)胞

1. 培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)到大約 80%-90%之間（直徑 10 cm 培養(yǎng)皿，~107個(gè)細(xì)胞），并用活性劑或抑制劑進(jìn)行處理。

2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

3. 向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個(gè)直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。

4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。

5. 用細(xì)胞刮棒把細(xì)胞從培養(yǎng)皿下分離下來(lái)。

6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會(huì)變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時(shí)，將細(xì)胞裂解物用 27½的注射器針頭來(lái)回吸取 3-4 次，以破壞基因    組DNA，從而避免上述情況的出現(xiàn)。

8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請(qǐng)將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

懸浮細(xì)胞

1. 培養(yǎng)細(xì)胞并用活化劑或抑制劑進(jìn)行處理。

2. 計(jì)數(shù)細(xì)胞后離心。

3. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

4. 向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個(gè)直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。

5. 反復(fù)吹打細(xì)胞進(jìn)行裂解。

6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會(huì)變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時(shí)，

  將細(xì)胞裂解物用 27½的注射器針頭來(lái)回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。    

8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請(qǐng)將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

 

C.體外用 GTPγS/GDP 處理蛋白以用作陽(yáng)性和陰性的對(duì)照(可選）

 

注意：在細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有 10% 的 Sar1 被激活，而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的 Sar1 被激活。 

 

1. 準(zhǔn)備兩個(gè)離心管，每個(gè)管中各加入 0.5 mL 的細(xì)胞提取物（如果是純的Sar1蛋白則每個(gè)管中加入的蛋白量為 1ug）。

2. 每個(gè)管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。

3. 一個(gè)管中加入 5ul 的 100X GTPγS（終濃度即為 100 uM）作為陽(yáng)性對(duì)照。另一個(gè)管中加入 5ul 的 100X GDP（終濃度即為 1 mM）作為陰性對(duì)照。

4. 將離心管置于 30°C 條件下反應(yīng) 30 min 并不斷攪動(dòng)。

5. 終止反應(yīng)：將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。 

 

D. 激活 Sar1 的親和沉淀

1. 加入 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細(xì)胞裂解物至微量離心管中。

2. 用1X Assay/Lysis 緩沖液。把每個(gè)樣品的總體積調(diào)整到1ml

3. 向管中加入 1ul 的活性 Sar1 單克隆抗體。(Cat.# 26916)

4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻，

5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心管中。

6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時(shí)，并輕輕的進(jìn)行搖動(dòng)。

7. 5000g，離心 1 分鐘。

8. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。

9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。

10. 最后一次洗滌后，小心的移去所有的上清。

11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。

12. 樣品煮沸 5min。 

13. 5000g，離心 10s。

 

E. 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 

1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。

2. 按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行 SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說(shuō)明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF 或硝化纖維素膜。 

4. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s，然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意：如果使用的是硝化纖維 素膜，此步省略。 

5. 封閉； 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時(shí)進(jìn)行封閉，并需要恒定振蕩。 

6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 孵育一抗：用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 稀釋Anti-Sar1 PAb(Cat.# 21090),稀釋比例為 1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的 Sar1 蛋 白的量）室溫下孵育 1-2 小時(shí)，或者 4°C 條件下過(guò)夜孵育.

8. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

9. 孵育二抗：（例如羊抗兔 IgG-HRP）用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育 1 小時(shí)并恒定振蕩。

10. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

11. 使用實(shí)驗(yàn)者所選擇的檢測(cè)方法進(jìn)行顯色如 ECL 顯色法。

 

 

 示例結(jié)果

 

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 Sar1 活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考

 

 

 

Sar1 活性分析

 

   Sar1蛋白用 GDP處理 (lane 2和3) 或 GTPγS (lane 4和5) 用抗活性的 Sar1 進(jìn)行免疫沉淀(Cat. No. 26916).用 anti Sar1 rabbit polyclonal antibody(Cat. No. 21090). 做免疫印跡分析。Sar1蛋白(lane 1)用 anti Sar1 rabbit polyclonal antibody(Cat. No. 21090). 做免疫印跡.作為參照 

 

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示例結(jié)果

 

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 Sar1 活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考

 

 

 

Sar1 活性分析

 

   Sar1蛋白用 GDP處理 (lane 2和3) 或 GTPγS (lane 4和5) 用抗活性的 Sar1 進(jìn)行免疫沉淀(Cat. No. 26916).用 anti Sar1 rabbit polyclonal antibody(Cat. No. 21090). 做免疫印跡分析。Sar1蛋白(lane 1)用 anti Sar1 rabbit polyclonal antibody(Cat. No. 21090). 做免疫印跡.作為參照